В основу иконы положен ветхозаветный сюжет «Гостеприимство Авраама», изложенный в восемнадцатой главе библейской книги Бытия. Он повествует о том, как праотец Авраам, родоначальник избранного народа, встретил у дубравы Мавре трех таинственных странников (в следующей главе они были названы ангелами). Во время трапезы в доме Авраама ему было дано обетование о грядущем чудесном рождении сына Исаака. По воле Бога, от Авраама должен был произойти «народ великий и сильный», в котором «благословятся… все народы земли». Затем двое ангелов отправились на погубление Содома — города, прогневившего Бога многочисленными злодеяниями его жителей, а один остался с Авраамом и беседовал с ним.

В разные эпохи этот сюжет получал различные толкования, однако уже к IX—X векам преобладающей становится точка зрения, согласно которой явление Аврааму трех ангелов символически раскрывало образ единосущного и триипостасного Бога — Святой Троицы.

Именно рублевская икона, как считают в настоящий момент учёные, как нельзя лучше соответствовала этим представлениям. Стремясь раскрыть догматическое учение о Св. Троице, Рублев отказывается от традиционных повествовательных деталей, которые традиционно включались в изображения Гостеприимства Авраама. Нет Авраама, Сарры, сцены заклания тельца, атрибуты трапезы сведены к минимуму: ангелы представлены не вкушающими, а беседующими. «Жесты ангелов, плавные и сдержанные, свидетельствуют о возвышенном характере их беседы».В иконе всё внимание сосредоточено на безмолвном общении трёх ангелов.

«Формой, наиболее наглядно выражающей представление о единосущии трех ипостасей Св. Троицы, в иконе Рублева становится круг — именно он положен в основу композиции. При этом ангелы не вписаны в круг — они сами образуют его, так что взгляд наш не может остановиться ни на одной из трех фигур и пребывает, скорее, внутри того пространства, которое они собой ограничивают. Смысловым центром композиции является чаша с головой тельца — прообраз крестной жертвы и напоминание об Евхаристии (силуэт, напоминающий чашу, образуют также фигуры левого и правого ангелов). Вокруг чаши, стоящей на столе, разворачивается безмолвный диалог жестов».

Левый ангел, символизирующий Бога Отца, благословляет чашу — однако рука его находится в отдалении, он как бы передает чашу центральному ангелу, который также благословляет ее и принимает, наклоном головы выражая свое согласие: «Отче Мой! Если возможно, да минует Меня Чаша Сия; впрочем не как Я хочу, но как Ты» (Матф. 26:39).

Свойства каждой их трех ипостасей раскрывают и их символические атрибуты — дом, дерево, гора. Исходным моментом божественного домостроительства является творящая воля Бога Отца, и поэтому над символизирующим Его ангелом Рублев помещает изображение палат Авраама. Дуб мамврийский переосмысляется как древо жизни и служит напоминанием о крестной смерти Спасителя и Его воскресении, открывающем дорогу к вечной жизни. Он находится в центре, над ангелом, символизирующим Христа.

Наконец, гора — символ восхищения духа, то есть, духовного восхождения, которое осуществляет спасенное человечество через непосредственное действие третьей ипостаси Троицы — Духа Святого (В Библии гора есть образ «восхищения духа», потому на ней и происходят самые значительные события: на Синае Моисей получает скрижали завета, Преображение Господне совершается на Фаворе, Вознесение — на горе Елеонской).

Единство трёх ипостасей Св. Троицы является совершенным прообразом всякого единения и любви — «Да будут все едино, как Ты, Отче, во Мне, и Я в Тебе, так и они да будут в Нас едино» (Ин.17:21). Лицезрение Св. Троицы (то есть, благодать непосредственного Богообщения) — заветная цель монашеской аскезы, духовного восхождения византийских и русских подвижников. Учение о сообщаемости божественной энергии как о пути духовного восстановления и преображения человека позволило как нельзя лучше осознать и сформулировать эту цель. Таким образом, именно особая духовная ориентация православия XIV века (продолжавшая древние традиции христианской аскезы) подготовила и сделала возможным появление «Троицы» Андрея Рублёва